Kompetitive Hemmung

Kompetitive Inhibitoren sind Substanzen, die mit dem Substrat um die Bindungsstelle im aktiven Zentrum des Enzyms konkurrieren. Sie werden nicht umgesetzt und können dadurch vom Substrat wieder verdrängt werden. Kompetitive Inhibitoren haben oft hohe Ähnlichkeit mit dem Substrat. Der Mechanismus der kompetitiven Hemmung ist in Abb. 3 dargestellt. Deutlich zu sehen ist, dass das Enzym E das Substrat S und den Inhibitor I nicht gleichzeitig binden kann. Durch die reversible Bindung von S bzw. I an E entsteht ein Gleichgewicht zwischen freiem Enzym E, dem Enzym-Substrat-Komplex ES und dem Enzym-Inhibitor-Komplex EI. Unter der Voraussetzung, dass sowohl das Substrat S als auch der Inhibitor I in sehr viel höheren Konzentrationen als das Enzym E vorliegen, kann man für den steady-state-Zustand folgende Reaktionsgeschwindigkeitsgleichung formulieren:

${\displaystyle v={\frac {V_{\max }\;[\mathrm {S} ]_{0}}{[\mathrm {S} ]_{0}+K_{m}\cdot i}}}$

Die enthaltenen Konstanten sind so definiert:

${\displaystyle V_{\max }=k_{2}\,[\mathrm {E} ]_{0},\qquad K_{m}={\frac {(k_{-1}+k_{2})}{k_{1}}}}$

und

${\displaystyle i=1+\left({\frac {k_{3}[\mathrm {I} ]_{0}}{k_{-3}}}\right)}$.

Die Reaktionsgeschwindigkeit ist in Abhängigkeit von der Ausgangssubstratkonzentration ${\displaystyle [\mathrm {S} ]_{0}}$ in Ab- und Anwesenheit des kompetitiven Inhibitors in Abb. 4 dargestellt. Die Michaelis-Menten-Konstante ${\displaystyle K_{m}}$ wird in Gegenwart des Inhibitors um den Faktor ${\displaystyle i}$ erhöht. Die Maximalgeschwindigkeit ${\displaystyle V_{\max }}$ bleibt jedoch unverändert.

Die Linearisierung der Michaelis-Menten-Auftragung wird durch den Reziprokwert der Gleichung erreicht.

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {1}{V_{\max }}}+{\frac {K_{m}\cdot i}{V_{\max }}}\;{\frac {1}{[\mathrm {S} ]_{0}}}}$

Die doppelt reziproke Auftragung, also die Auftragung von ${\displaystyle 1/v}$ gegen ${\displaystyle 1/[\mathrm {S} ]_{0}}$ in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des Inhibitors ist in Abb. 5 dargestellt und wird Lineweaver-Burk-Auftragung genannt. Die Steigung des Graphen erhöht sich in Anwesenheit des Inhibitors um ${\displaystyle i}$. Da ${\displaystyle V_{\max }}$ unverändert bleibt, schneiden sich alle Geraden auf der Ordinate im Punkt ${\displaystyle 1/V_{\max }}$. Die Schnittpunkte mit der Abszisse spiegeln den Wert ${\displaystyle -1/K_{m}i}$ wider.

Die oben beschriebenen Gleichungen wurden für die kompetitive Hemmung abgeleitet, bei der die gleichzeitige Bindung von Substrat und Inhibitor ausgeschlossen wird. Die Bedingungen für eine kompetitive Hemmung können aber auch erfüllt werden, wenn der Inhibitor nicht die gleiche Bindungsstelle am Enzym einnimmt wie das Substrat. Eine Bindung im aktiven Zentrum, wodurch die Substratbindung sterisch eingeschränkt ist, führt auch zum kompetitiven Hemmtyp.

Nichtkompetitive und allosterische Hemmung

Bei der allosterischen Hemmung (griech.: allos: anders; steros: Ort) lagern sich die Inhibitoren, auch allosterische Effektoren genannt, nicht (wie bei der kompetitiven Hemmung) an das aktive Zentrum, sondern an einer anderen Stelle des Enzyms an, das allosterische Zentrum. Dabei wird die Konformation des Enzyms so verändert, dass die Bindung des Substrats am aktiven Zentrum erschwert bzw. ganz unmöglich gemacht wird.

Die allosterische Hemmung lässt sich nur durch die Entfernung des Effektors rückgängig machen. Ein Enzym, das die erste Reaktion einer Reaktionskette katalysiert, wird oft durch die am Ende gebildete Substanz gehemmt. In diesem Falle bezeichnet man diese negative Rückkopplung als Endprodukthemmung oder Feedback-Hemmung.

Bei der nichtkompetitiven Hemmung wird durch Bindung des Inhibitors I an das Enzym E die Substratbindung nicht beeinflusst. Da der Inhibitor I nicht im substratbindenden, aktiven Zentrum andockt, ist er in der Lage sowohl an das freie Enzym E als auch an den Enzym-Substrat-Komplex ES zu binden. Das Substrat kann mit dem Enzym-Inhibitor-Komplex EI zwar chemisch reagieren, jedoch ist die Abspaltung des Produkts P gehemmt (Abb. 6).

Unter steady-state-Bedingungen kann eine Geschwindigkeitsgleichung hergeleitet werden:

${\displaystyle v={\frac {V_{\max }\;[\mathrm {S} ]_{0}}{i\cdot ([\mathrm {S} ]_{0}+K_{m})}}}$.

Die Konstanten ${\displaystyle K_{m}}$ und ${\displaystyle i}$ sind folgendermaßen definiert: ${\displaystyle K_{m}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$ und ${\displaystyle i=1+(k_{3}[\mathrm {I} ]_{0}/k_{-3})}$. Aus der Geschwindigkeitsgleichung kann man ableiten, dass der nichtkompetitive Inhibitor die Maximalgeschwindigkeit ${\displaystyle V_{\max }}$ um den Faktor ${\displaystyle 1/i}$ verringert. Der ${\displaystyle K_{m}}$-Wert für das Substrat bleibt unverändert.

Die Auftragung nach Lineweaver-Burk mit der Formel

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {i}{V_{\max }}}+{\frac {K_{m}\cdot i}{V_{\max }}}\;{\frac {1}{[\mathrm {S} ]_{0}}}}$.

ist in Abb. 8 dargestellt. Die reziproke Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der reziproken Substratkonzentration ist in Gegenwart eines nichtkompetitiven Inhibitors i-fach erhöht, der Ordinatenschnittpunkt ergibt den Wert ${\displaystyle i/V_{\max }}$. Die Reaktionsgeraden bei unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen schneiden sich auf der Abszisse in dem Punkt mit dem Wert ${\displaystyle -1/K_{m}}$.

In manchen Fällen der nichtkompetitiven Hemmung weicht das Verhalten des Inhibitors etwas vom „Normalfall“ ab. Die Umsetzung des Inhibitors mit dem Enzym erfolgt dann sehr viel schneller als die des Substrates. Bei niedrigen Substratkonzentrationen ist die Verminderung der Maximalgeschwindigkeit nicht so stark. Daher ergibt sich für die Bedingungen ${\displaystyle k_{-1}\ll k_{2}}$ und ${\displaystyle K_{m}=k_{2}/k_{1}}$ folgende Geschwindigkeitsgleichung:

${\displaystyle v={\frac {V_{\max }\;[\mathrm {S} ]_{0}}{[\mathrm {S} ]_{0}\cdot i+K_{m}}}}$.

Bei Ermittlungen des Hemmtypes eines Inhibitors sollte mit einem solchen Verhalten gerechnet werden.

Unkompetitive Hemmung

Gelegentlich kommt neben der kompetitiven und der nichtkompetitiven Hemmung auch der unkompetitive Hemmtyp vor. Dabei geht der Inhibitor nur mit dem Enzym-Substrat-Komplex ES eine Reaktion ein, wie in Abb. 9 zu sehen ist. Die für diesen Mechanismus unter steady-state-Bedingungen abgeleitete Gleichung für die Reaktionsgeschwindigkeit lautet wie folgt:

${\displaystyle v={\frac {V_{\max }\;[\mathrm {S} ]_{0}}{i\cdot \left({\frac {K_{m}}{i}}+[\mathrm {S} ]_{0}\right)}}}$

Die Konstanten sind so definiert: ${\displaystyle i=1+k_{3}[\mathrm {I} ]_{0}/k_{-3}}$ und ${\displaystyle K_{m}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$. Aus der in Abb. 10 dargestellten Michaelis-Menten-Auftragung einer unkompetitiven Hemmung kann man sehen, dass durch den Inhibitor sowohl die maximale Reaktionsgeschwindigkeit als auch der ${\displaystyle K_{m}}$-Wert verändert wird.

Durch Umformung der Geschwindigkeitsgleichung in die reziproke Form kann die Abhängigkeit von Reaktionsgeschwindigkeit zu Ausgangskonzentration des Substrates linearisiert dargestellt werden:

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {i}{V_{\max }}}+{\frac {K_{m}}{V_{\max }}}\;{\frac {1}{[\mathrm {S} ]_{0}}}}$

Aus dieser Formel ist zu erkennen, dass der Anstieg unabhängig vom unkompetitiven Inhibitor ist, das heißt, die Graphen liegen bei unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen parallel zueinander. Die Nullstelle gibt den Wert ${\displaystyle i/K_{m}}$ wieder. Die Geraden schneiden die Ordinate im Punkt ${\displaystyle i/V_{\max }}$.

Die unkompetitive Hemmung kommt zum Beispiel bei Oxidasen vor, wenn der Inhibitor nur mit einer bestimmten Oxidationsstufe des Enzyms reagieren kann. Eine weitere Möglichkeit für einen unkompetitiven Inhibitor bietet sich bei einem Ordered-Mechanismus, einer Zwei-Substratreaktion, bei der der Inhibitor konkurrierend zu einem der Substrate auftritt.

Partiell kompetitive Hemmung

Eine partiell-kompetitive Hemmung gibt es definitionsgemäß eigentlich nicht, da bei der kompetitiven Hemmung Substrat und Hemmstoff nicht gleichzeitig an das Enzym binden können, es gibt also keinen EIS-Komplex der Substrat umsetzen könnte. In der älteren Literatur wird dieser Ausdruck jedoch für einen Spezialfall der partiell-nichtkompetitiven Hemmung gebraucht mit k_cat = k_*. In diesem Fall ähnelt der Lineweaver-Burk-Plot einer kompetitiven Hemmung, der Sekundärplot ist gekrümmt. Der Ausdruck „partiell-kompetitiv“ ist also mechanistisch falsch und sollte nicht mehr verwendet werden.

Substratüberschusshemmung

Durch sehr hohe Substratkonzentrationen kann es bei manchen Enzymen zur Bindung eines zweiten Substratmoleküls an das Enzym kommen. Der so entstandene ESS-Komplex ist nicht in der Lage in Produkt und Enzym zu zerfallen. Für diesen Reaktionsmechanismus lautet die Geschwindigkeitsgleichung:

${\displaystyle v={\frac {V_{\max }}{1+{\frac {K_{m}}{[\mathrm {S} ]_{0}}}+{\frac {[\mathrm {S} ]_{0}}{K_{i}}}}}}$

Die Dissoziationskonstante des ESS-Komplexes wurde als ${\displaystyle K_{i}}$ bezeichnet. Wenn der ${\displaystyle K_{m}}$-Wert sehr viel niedriger als der ${\displaystyle K_{i}}$-Wert ist, erhält man eine hyperbole Abhängigkeit in der Michaelis-Menten-Auftragung (Abb. 13, Kurve 1). Sind diese beiden Werte annähernd gleich oder der ${\displaystyle K_{m}}$-Wert höher, so entsteht sozusagen eine Optimumkurve (Abb. 13, Kurve 2).

Hemmung durch Reaktion eines Inhibitors mit dem Substrat

Bei diesem Hemmtyp reagiert der Inhibitor mit dem Substrat, welches dann von dem Enzym nicht mehr umgesetzt wird. Die Bindung des Inhibitors wird bei dieser Hemmung als reversibel angesehen. Dadurch wird die dem Enzym frei zugängliche Substratkonzentration ${\displaystyle [\mathrm {S} _{\mathrm {eff} }]}$ herabgesetzt:

${\displaystyle [\mathrm {S_{eff}} ]=[\mathrm {S} ]_{0}-[\mathrm {SI} ]}$

In Gegenwart des Inhibitors wird die Maximalgeschwindigkeit bei hohen Substratkonzentrationen erreicht. Im Lineweaver-Burk-Diagramm lässt sich dieser Mechanismus von einem kompetitiven Inhibitor differenzieren, da eine Abweichung von der Linearität auftritt.