Single Guide RNA (sgRNA) ist eine künstliche RNA, die in der CRISPR/Cas-Methode, der CRISPRi oder der CRISPRa in Kombination mit Cas9 oder Cas12b verwendet wird.

Eigenschaften

Die sgRNA bildet eine Sekundärstruktur, die als R-loop bezeichnet wird. Sie kann in Bakterien, Hefen, Fruchtfliegen, Zebrafischen und Mäusen verwendet werden. Daraufhin wird sie von Cas-Proteinen des Typs I und II gebunden. Natürlicherweise bindet Cas9 zwei RNA, die crRNA und die tracrRNA, während bei der Methode nur eine aus Sequenzen der beiden RNA bestehende sgRNA verwendet wird. Dadurch muss für die CRISPR/Cas-Methode nur eine RNA kloniert werden. Eine sgRNA besteht aus den 20 Nukleotiden strangaufwärts (in 5'-Richtung) von einem Protospacer Adjacent Motif (PAM) der zu schneidenden Ziel-DNA und einem Teil der tracrRNA. Bevorzugt befindet sich am 5'-Ende der 20 Nukleotide (Position 1) ein Guaninnukleotid (GC-clamp) und vier Nukleotide vor dem PAM (Position 17) ein Adenin- oder Thyminnukleotid. Programme zur Identifikation von 20 Nukleotiden vor einem PAM bzw. zum Entwerfen einer sgRNA sind beispielsweise CHOPCHOP, CasOFFinder, FlyCRISPR, CRISPR-ERA, SgRNA Designer, CRISPOR, E-CRISP und CRISPRdirect.

Meistens werden zum Einschleusen der sgRNA in eukaryotische Zellen virale Vektoren transduziert oder Plasmide transfiziert. Bei Verwendung zur Gentherapie in Eukaryoten wird ein eukaryotischer Promotor verwendet. Im Falle einer Einschleusung des Cas-Proteins und der sgRNA in eine Zelle wird die sgRNA vorher durch In-vitro-Transkription aus einem Vektor beispielsweise mit einem T7-Promotor erzeugt.

Einzelnachweise

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