Beispiel
- IGF 2 µg/µl, 34 kDa
- Peptid 1,5 µg/µl, 5 kDa
- 6 verschiedene molare Verhältnisse (1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100)
- 5 verschiedene Zeiten (0, 5, 15, 30, 60 Minuten)
- Reaktion findet bei Raumtemperatur statt
Berechnung
Konzentration (in picoMol)
| Cx [pmol/µl]=
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1.000 * Cx [µg/µl]
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| MWx [kDa]
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Daher:
- IGF : 58,8 pmol/µl
- Peptid : 300 pmol/µl
Endkonzentration IGF soll 2 µM/µl betragen
70 µl je Ansatz (5 Zeitwerte + 2 zur Sicherheit, je 10 µl)
Berechnung der µl IGF pro Ansatz
| x =
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2 µM * 70 µl
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= 2,38 µl = ca. 2,4 µl
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| 58,8 pmol/µl
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6 Ansätze à 70 µl
| IGF:Peptid
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IGF
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Peptid
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KP
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TRIS
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| 1:1
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2,4 µl
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0,4 µl
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7 µl
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60,2 µl
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| 1:10
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2,4 µl
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4,6 µl
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7 µl
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56,0 µl
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| 1:20
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2,4 µl
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9,3 µl
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7 µl
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51,3 µl
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| 1:30
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2,4 µl
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14,0 µl
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7 µl
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46,6 µl
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| 1:50
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2,4 µl
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23,3 µl
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7 µl
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37,3 µl
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| 1:100
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2,4 µl
|
46,6 µl
|
7 µl
|
14,0 µl
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TRIS : 50mM pH7.5; KP = 10× Kinasepuffer
IGF:Peptid meint das molare Verhältnis
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Durchführung
- 5 Zeitwerte × 6 molare Verhältnisse = 30 Eppis vorbereiten, SDS-Probenpuffer oder Quenching-Puffer (für native Gelelektrophorese) in jedes Eppi geben
- Alles bis auf Kinasepuffer zusammenpipettieren
- Ggfs. Nullwerte (Zeit=0) entnehmen (nur 6 µl)
- Zeit startet bei der Zugabe von Kinasepuffer; festes Zeitschema wählen (z.B. 20 Sekunden pro Ansatz)
- Bei jedem Zeitwert aus jedem Ansatz 10 µl entnehmen (Zeitschema beachten), in vorbereitetes Eppi geben, ggfs. kurz anzentrifugieren (bei Verwendung von Quenching-Puffer Eppi auf Eis stellen)
- Die Proben können über Nacht bei -20°C gelagert werden
Materialien
Kinasepuffer
| 10×
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100 µl
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| ATP 100 mM
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20 µl 0,5M oder 40 µl 0,25M
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| MgCl2 200 mM
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30 µl 1M
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| TRIS pH 7.5 50 mM
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10 µl 0,5M
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| DTT 10 mM
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1 µl 1M
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| TRIS
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39 (bzw. 19) µl 50mM pH 7.5
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| !ATP in 50 mM TRIS oder HEPES auf pH 7.0 einstellen!
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Quenching-Puffer
| 4×
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100 µl
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10 ml
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| EDTA 0,5M
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50 µl
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5 ml
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| TRIS 3M
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12,5 µl
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1,25 ml
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| 1M DTT
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10 µl
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1 ml
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| Saccharose 60%
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26,5 µl
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2,65 ml
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| 1% Bromphenolblau
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1 µl
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100 µl
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