Nuklease A ist ein Enzym des Bakteriums Serratia marcescens aus der Gruppe der Endonukleasen.

Eigenschaften

Die gentechnisch modifizierte Form der extrazellulären Nuklease von Serratia marcescens, wird in E. coli Stamm W3110 exprimiert. In E. coli wird dieses Enzym durch das Plasmid pNUC1 codiert. Endonuklease aus Serratia marcescens wird im Zuge der Proteinreinigung verwendet, um Nukleinsäuren in Zelllysaten abzubauen und so deren Viskosität zu vermindern, die Reinigung der Proteine zu erleichtern und behördliche Anforderungen an die Nukleinsäure-Freiheit von Protein-Pharmazeutika zu erfüllen. Teilweise wird sie auch immobilisiert eingesetzt. Die Nuklease A ist strukturell mit der silkworm nuclease, Kartoffel-Nuklease und der Azotobacter-Nuklease verwandt.

Struktur

Die extrazellulären Endonuklease aus Serratia marcescens ist ein Homodimer, die Untereinheiten haben nach Abspaltung der Signalsequenz zur Sekretion (Position 1–21) 245 Aminosäuren und eine relative Molekülmasse von circa 30 kDa. Das Enzym benötigt Mg²⁺ (1–2 mM) als Cofaktor und hat zwei essenzielle Disulfidbindungen. Das Enzym kann arbeiten in Anwesenheit von Detergenzien, Harnstoff, Phenol, PMSF und Thiolen. Es wird durch Salzkonzentrationen > 20 mM gehemmt. Der optimale pH-Wert liegt bei 8 (Arbeitsbereich 6–10), die optimale Temperatur bei 35 °C (Arbeitsbereich 0–42 °C). Die Struktur wurde 1997 und 2000 publiziert.

Spezifität

Diese Nuklease hat breite Substratspezifität gegen DNA und RNA (linear, zirkulär, einfach oder Doppelstrang) mit einer leichten Präferenz für G/C-reiche Segmente, diese werden in Oligonukleotide gespalten, die eine Länge von 2–5 Nukleotiden und ein 5'-Monophosphat haben. Diese Nuklease hat keine messbare Protease-Aktivität. Theoretisch ist es auch möglich, in der Impfstoffproduktion Bakterien und Viren mit dieser Nuklease nicht-infektiös zu machen.

Einzelnachweise

1. ↑ CAS 9025-65-4, PDB 4e3y, EC 3.1.30.2 bei BRENDA.
2. ↑ P. Friedhoff, O. Gimadutdinow, T. Rüter, W. Wende, C. Urbanke, H. Thole, A. Pingoud: A procedure for renaturation and purification of the extracellular Serratia marcescens nuclease from genetically engineered Escherichia coli. In: Protein expression and purification. Band 5, Nummer 1, Februar 1994, S. 37–43, doi:10.1006/prep.1994.1005, PMID 8167472.
3. ↑ Patent US5173418A: Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases. Angemeldet am 7. Februar 1990, veröffentlicht am 22. Dezember 1992, Anmelder: Benzon Pharma AS, Erfinder: Soren Molin, Michael Givskov, Erik Riise.‌
4. ↑ J. M. Moreno, J. M. Sanchez-Montero, A. Ballesteros, J. V. Sinisterra: Hydrolysis of nucleic acids in single-cell protein concentrates using immobilized benzonase. In: Applied biochemistry and biotechnology. Band 31, Nummer 1, Oktober 1991, S. 43–51, PMID 1665680.
5. ↑ ENZYME - 3.1.30.2 Serratia marcescens nuclease. In: enzyme.expasy.org. Abgerufen am 16. November 2021 (englisch). 
6. ↑ V.Yu Lunin, V.M Levdikov, S.V Shlyapnikov, E.V Blagova, V.V Lunin, K.S Wilson, A.M Mikhailov: Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7 Å resolution and mechanism of its action. In: FEBS Letters. 412, 1997, S. 217, doi:10.1016/S0014-5793(97)00512-7.
7. ↑ S. V. Shlyapnikov, V. V. Lunin, M. Perbandt, K. M. Polyakov, V. Y. Lunin, V. M. Levdikov, C. Betzel, A. M. Mikhailov: Atomic structure of the Serratia marcescens endonuclease at 1.1 A resolution and the enzyme reaction mechanism. In: Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. Band 56, Pt 5Mai 2000, S. 567–572, doi:10.1107/s090744490000322x, PMID 10771425.
8. ↑ J.M. Moreno, J.M. Sanchez-Montero, J.V. Sinisterra, L.B. Nielsen: Contribution to the study of the enzymatic activity of benzonase. In: Journal of Molecular Catalysis. 69, 1991, S. 419, doi:10.1016/0304-5102(91)80120-R.
9. ↑ M. Nestle, W. K. Roberts: An extracellular nuclease from Serratia marcescens. II. Specificity of the enzyme. In: Journal of Biological Chemistry. Band 244, Nummer 19, Oktober 1969, S. 5219–5225, PMID 4310088.