Cas9 (von englisch CRISPR-associated, veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) ist eine Endonuklease und ein Ribonukleoprotein aus Bakterien.

Eigenschaften

Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem CRISPR. Die Endonuklease Cas9 kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG) binden und DNA schneiden. Diese crRNA repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur, bindet eine tracrRNA und wird dann von Cas9 gebunden. An der crRNA repeat-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA spacer), beide Sequenzen werden zusammen als crRNA bezeichnet. Als zweiter Teil dient die crRNA spacer-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Dadurch wird die DNA nahe der Bindungsstelle geschnitten. Zur Hemmung von Cas-Proteinen werden von Bakteriophagen Anti-CRISPR-Proteine gebildet.

Struktur

Cas9 besteht aus zwei Bereichen, mit der RNA eingebettet zwischen dem α-helikalen Bereich (blau) und dem Bereich der Endonuklease (cyan, orange, grau). Die beiden Bereiche sind über eine Helix verbunden. Der Nukleasebereich enthält zwei Endonuklease-Proteindomänen, RuvC (grau) und die HNH-Nuclease (cyan). Die HNH-Nuklease schneidet den an die crRNA gebundenen DNA-Strang, während die RuvC den gegenüberliegenden Strang schneidet. Die zu schneidende DNA muss das Protospacer adjacent Motif (PAM) enthalten, das aus den drei Nukleotiden NGG besteht, und von der PAM-interacting domain am C-Terminus von Cas9 (PI-Domäne, orange) gebunden wird. Cas9 besitzt drei verschiedene Konformationen, ungebunden, an RNA gebunden und an RNA und DNA gebunden.

Cas9 bindet die stem-loop-Sekundärstruktur der crRNA. Der Komplex aus Cas9, crRNA und tracrRNA bindet an die Ziel-DNA und schneidet beide DNA-Stränge. Die beiden RNA können auch in einem einzigen, abschnittsweise selbsthybridisierenden Strang untergebracht werden (single-guide RNA, sgRNA). Die DNA-Bindungsdomäne (recognition domain, REC) die Endonukleasedomäne (NUC) sind räumlich getrennt. Da die HNH-Domäne flexibel mit dem restlichen Protein verbunden ist, ist sie im Cas9-Proteinkristall nicht erkennbar. Cas9 verwendet Manganionen als Cofaktoren.

Typen

Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien. Die Familien können in drei Typen eingeteilt werden. Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ IIIb einzelsträngige RNA bindet und schneidet. Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2. Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt. Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt. Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.

Anwendungen

Cas9 wird als Bestandteil des CRISPR/Cas-Systems zum Genome Editing verwendet.

Einzelnachweise

1. ↑ R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. In: Nature reviews. Microbiology. Band 6, Nummer 3, März 2008, S. 181–186, ISSN 1740-1534. doi:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.
2. ↑ D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lundgren: The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. In: Biochimie. Band 117, Oktober 2015, S. 119–128, doi:10.1016/j.biochi.2015.03.025, PMID 25868999 (Review).
3. ↑ G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 109, Nummer 39, September 2012, S. E2579–E2586, ISSN 1091-6490. doi:10.1073/pnas.1208507109. PMID 22949671. PMC 3465414 (freier Volltext).
4. ↑ V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. In: Genome biology. Band 8, Nummer 4, 2007, S. R61, ISSN 1465-6914. doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. PMID 17442114. PMC 1896005 (freier Volltext).
5. ↑ Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA: RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. In: Nature. 482. Jahrgang, Nr. 7385, Februar 2012, S. 331–8, doi:10.1038/nature10886, PMID 22337052, bibcode:2012Natur.482..331W. 
6. ↑ Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F: Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. In: Nat Protoc. 8. Jahrgang, Nr. 11, 2013, S. 2281–308, doi:10.1038/nprot.2013.143, PMID 24157548, PMC 3969860 (freier Volltext). 
7. ↑ Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. In: Science. 337. Jahrgang, Nr. 6096, 2012, S. 816–21, doi:10.1126/science.1225829, PMID 22745249, bibcode:2012Sci...337..816J. 
8. ↑ M. Jinek, F. Jiang, D. W. Taylor, S. H. Sternberg, E. Kaya, E. Ma, C. Anders, M. Hauer, K. Zhou, S. Lin, M. Kaplan, A. T. Iavarone, E. Charpentier, E. Nogales, J. A. Doudna: Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. In: Science. Band 343, Nummer 6176, März 2014, S. 1247997, doi:10.1126/science.1247997, PMID 24505130, PMC 4184034 (freier Volltext).
9. ↑ D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. In: PLoS computational biology. Band 1, Nummer 6, November 2005, S. e60, ISSN 1553-7358. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. PMID 16292354. PMC 1282333 (freier Volltext).
10. 1 2 3 4 D. W. Taylor, Y. Zhu, R. H. J. Staals, J. E. Kornfeld, A. Shinkai, J. van der Oost, E. Nogales, J. A. Doudna: Structures of the CRISPR-Cmr complex reveal mode of RNA target positioning. In: Science. 348, 2015, S. 581, doi:10.1126/science.aaa4535.
11. 1 2 3 J. van der Oost, E. R. Westra, R. N. Jackson, B. Wiedenheft: Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems. In: Nature reviews. Microbiology. Band 12, Nummer 7, Juli 2014, S. 479–492, doi:10.1038/nrmicro3279, PMID 24909109, PMC 4225775 (freier Volltext) (Review).