Assassin's Creed Brotherhood beginnt genau an dem Punkt an dem Assassin's Creed 2 endet. Das Assassinen-Team muss sich eine neue Assassinen-Basis suchen, da sie von der Polizei entdeckt wurde (wäre ja kein Problem, Desmond kann ja alleine um die zwanzig Cops massakrieren). Die neue Basis befindet sich in Monteriggioni, das nach über 500 Jahren immer noch ein runtergekommenes Kaff ist. Das Team will aber nach Italien, weil es da gerade sonnig ist, nur schade, dass Desmond als einziger nur Nachts hinaus darf. Man wird sofort mit dem Animus 2.0 verkabelt, der jedoch wegen schlechter Garantie technische Probleme aufweist, wie im ersten Teil der Reihe. So muss man alles von vorne nachspielen, um endlich zum Punkt zu kommen. Auch diesmal zockt Desmond in der Haut seines italienischen Assassinen-Vorfahren Ezio Auditore da Firenze, der nach seiner "Reise nach Rom" mit seinem Onkel Mario vorhat, ein Rentnerleben zu genießen, was glücklicherweise für den Spieler wieder einmal schiefgeht. Der Hintergrundgedanke daran ist, endlich mal den Edensplitter im Jahr 2012 zu finden, da es die modernen Assassinen ihren Vorfahren nachmachen wollen. Am Ende findet das Team den Edensplitter, nachdem Desmond die ganze Arbeit geleistet hat, und zu guter Letzt ersticht dieser die Verrückte, die ihn im zweiten Teil der Reihe ent- und in allen drei Teilen verführt hat.

Ezio hat Mario Barth, den Papst der "Katholischen Kirche der Komiker" besiegt und ihn verschonend mit Minderwertigkeitskomplexen zurückgelassen, obwohl er im vorhergehenden Teil dreißig Jahre lang versucht hat, ihn umzubringen. Nun will Ezio zusammen mit Onkel Mario in die heiß ersehnte Rente gehen, zieht sich in Monteriggioni zurück, feiert mehr oder weniger seinen Sieg mit seinen Freunden und verbringt eine bewegte Nacht mit der Gräfin von Forlí aus politischen Gründen. Am nächsten Morgen wird das Dorf von Cäsars Armada angegriffen, der höchstpersönlich Mario erschießt und dessen Scharfschützen in Ezio eine Salve feuern. Dieser überlebt natürlich und flieht mit Mama und Schwesterchen aus dem zerstörten Monteriggioni, das man im Vorgänger mit Mühe restauriert hat. Cäsar ist der Sohn von Mario Barth und hat somit die Minderwertigkeitskomplexe ohne Erlaubnis von Papi gerächt. Klarerweise will sich Ezio nun an die Familie Barth rächen, doch da Rom, deren Mafia-Hochburg, zu groß ist, beschließt er, einfach deren Business zu verderben und dann die Familie aus zu rotten.

Ich bin Ezio Auditore da Firenze, Meister der Assassinen, ...

• ich bin fast fünfzig Jahre alt, doch immer noch so fit wie mit zwanzig
• ich habe gelernt, während des Kampfes auch meine Pistole zu benutzen
• ich bin der Zuhälter der Prostituierten in Rom
• meine Schwester leitet das Bordell, nachdem sie Monteriggioni verwaltet hat (Fazit: in Italien funktionieren Dörfer genauso wie Bordelle)
• Mudda hilft ihr dabei, weil sie sich vom jahrelangen Knien erholt hat
• nach Jahren habe ich endlich einen Halter für große Waffen zum Kaufen gefunden
• ich restauriere das runtergekommene Rom und mache dabei ein Megageschäft
• wenn ich irgendein altes, runtergekommenes Monument restauriere, ändert sich dabei nur, dass es mir gehört
• ich zerstöre Leonardos Maschinen immer, nachdem ich mich mit ihnen vergnügt habe, anstatt sie weiterhin für meine Zwecke zu benutzen
• als heldenhafter Rächer meines Onkels kommt Cäsar erst als letzter dran, obwohl ich ihn ständig begegne
• meine Schüler sind besser als ich, sie können sogar aus dem Nichts erscheinen
• ich habe gelernt, wie ein Adler zu kreischen, um meine Kumpels zu rufen
• bei langen Kombos kann ich jeden Gegner mit einem Schlag umlegen, nur bei Cäsar funktioniert das nicht
• ich treffe Cesares Hals nicht auf 30 cm Entfernung, nur schade, dass Leonardo noch keine Brillen erfunden hat
• ich und meine Gegner können einhändig mit einer Armbrust umgehen und dabei erziele ich ständig Volltreffer
• ich trete meinen Feinden in die Eier, um deren Verteidigung zu brechen
• Ich kann meinen homosexuellen Freunden, noch so viele Bolzen in die Brust rammen. Schmerz verspüren sie keinen !
• Ich kann 4 Wachen auf einmal innerhalb einer Sekunde mit einer Dolch-Kombo töten!
• Falls mein Gegner eine Attacke blockt, einfach eine Axt nehmen und von 2 cm Distanz ins Gesicht werfen (funktioniert auch bei Endgegnern)
• Alle Pferde in Rom sind auf mein Pfeifen abgerichtet!

• "Niemand kann so tief sinken wie Blondie Barth. Wer hat dich so behandelt, dein Bruder oder dein Vater, oder vielleicht beide gleichzeitig?" - Ezios Schlampe, Gräfin von Forlí
• "Komm hinein, oder ich bringe dich um" - Römische Gastfreundschaft
• "Niemand kann mich umbringen, kein Mensch kann mich umbringen" - Cesare, total außer Kraft nach dem Kampf gegen Ezio, bevor dieser ihm das Fliegen beibringt
• "Ich habe es für mein Land getan" - Gräfin von Forlí, nach der heißen Nacht mit ihm (Fazit: italienische Diplomatie ist interessanter als jede andere -> siehe Silvio Berlusconi)
• "Keine Angst. Mädchen lenken mich nicht ab" - Leonardo als er versuchte Ezio auf der Bank zu vergewaltigen.
• "Ihr habt nichts zwischen euren Beinen! Nur ein großes, tiefes Loch!" Bartolomeo als er dem Franzosen klar macht das das seine Hure ist.
• "Lebenserwartung: Etwa 5 Minuten" - Zivilisten, die Ezio beim klettern beobachten.

Handlung hat das Spiel keine, da sich das Entwicklerteam ausschließlich auf den Multiplayer-Modus konzentrierte. Auf die Frage, ob es auch eine Singleplayer- oder wenigstens eine COOP-Singleplayer-Kampagne geben wird fragten die Entwickler entrüstet: "WTF is Singleplayer?".

Der Multiplayer wurde auf Kosten des Singleplayers dafür enorm ausgebaut. Die Spielmodi sind neben den herkömmlichen Free for All, Capture the Flag oder Team Deathmatch sehr verschieden und von der Karte abhängig die man spielt. So kann man beispielsweise auf der Karte "Mission Türkei" wählen, ob man dem Döner-Team oder dem Wurstsemmel-Team beitreten möchte. In diesem Spielmodi geht es darum die Zutaten für besagte Speisen zu sammeln und das gegnerische Team am Sammeln derer Zutaten mit Waffengewalt zu hindern. Für das perfekte Döner braucht man im Spiel: Hammelfleisch, Zwiebel, Tomaten, komische Soße und natürlich die Döner-Semmel. Das Wurstsemmel-Team ist hinter Extrawurst, Käse, Gurkerl, Senf und einer normalen Semmel her. Die besagten Zutaten werden auf der 30 km² großen Karte zufallsgeneriert abgelegt und müssen gefunden werden. Wobei man gegnerische Zutaten aufnehmen und in die Mülltonne befordern kann. Aus der Mülltonne können die Zutaten nur durch einen freischaltbaren "Gammler"-Charakter gerettet werden, ansonsten bleiben sie 30 Sekunden lang in der Tonne, bevor sie wieder neu generiert werden.

Über weitere Spielmodi ist noch nicht viel bekannt...

So erfolgreich das Spiel von den Entwicklern auch gepriesen wurde so fatal war es auch zum Scheitern verurteilt. Der schicksalhafte Tag, war jener an dem das Entwicklerteam die ersten Tester für das Spiel beauftragten. Gleich bei der ersten Partie kam es zu einem Todesfall. Ein Tester erwürgte einen anderen mit dessem Controller-Kabel. Als Rechtfertigung für die Mordtat gab er nur an, dass sein Gegenspieler ein Cheater und Kackb00n wäre. Bei genauerer Recherche des Spiels konnte ermittelt werden, dass der ermordete Spieler gerade gekonnt ein Haus erklomm, während er von dem anderen unter Beschuss genommen wurde. Die detailierte Aufzeichnung ergab, dass er einfach zu blöd war zu treffen und von einem Wurfmesser das der ermordete Spieler vom Hausdach auf seinen Kontrahenten warf getötet wurde. Als der Mörder erkannte, dass er eigentlich der Kackb00n war, ging er auf einen Programmierer los, welcher sich aber durch einen als Elektroschocker benutzten Defibrillator retten konnte. Doch durch diese Vorfälle blickte das Entwicklerteam sehr missmutig auf ihre Schöpfung.

Auch die nächsten Tester bekamen durch das Spiel enorme Nerdwut. Es war von zerbissenen und verschluckten Gamecontrollern, einem Typen der andauernd gegen die Wand rannte und einem Typ, der das Spiel sofort beherrschte aber davon so besessen wurde, dass er 24h durchtestete und sich dabei nur von seinem Urin und seiner Kacke ernährte, die Rede. Es wurden auch absolute ruhige Zeitgenossen eingesetzt, die einen enormen Anstieg der Aggression verzeichneten, wenn sie das Spiel spielten, aber noch aggressiver wurden, wenn sie es NICHT spielten.

Somit war den Entwicklern klar, dass dieses einmalige und absolut beispielslose Spiel den Untergang der Menschheit einläuten würde. Deshalb wurde es weltweit indiziert, wird aber von der USA zu Verhörzwecken verwendet.

Obwohl es nie in die Verkaufsstände kam, bekam das Spiel dennoch einen Eintrag ins Guiness Buch der Rekorde, da es das bisher einzige Spiel ist, welches auf der Verpackung einen Schreibfehler hat.